Kromatografi

           Asam amino merupakan bagian stuktur protein dan menentukan banyak sifat yang penting. Glisin mereupakan asam amino pertama yang telah diisolasi dari hidrosilat protein, sedangkan treonin merupakan asam amino pembentuk potein yang dapat diisolasi paling akhir yang berasal dari hidrosilat fibrin (Wirahadikusumah, 1989).

            Pada asam amino terdapat tiga gugus yang reaktif yaitu gugus α-karboksil, gugus α-amino, dan gugus rantai samping (R). Ketiga gugus ini dapat diidentifikasi melalui uji spesifik, diantaranya adalah dengan uji ninhidrin, uji Edman, uji Sanger, dan sebagainya. Selain menggunakan uji spesifik yang berdasarkan ciri khas reaksi kimia asam amino, asam amino juga dapat diidentifikasi bahkan dapat dipisahkan dengan menggunakan metode tertentu.

            Beberapa metode analisis asam amino yang dapat digunakan untuk identifikasi dan pemisahan asam amino adalah metode gravimetric, kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis. Salah satu metode yang banyak memperoleh pengembangan ialah metode kromatografi. Macam-macam kromatografi ialah kromatografi kertas, krometografi lapis tipis dan kromatografi penukar ion (Poedjiadi, 1994).

            Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas). Dari pengertian tersebut dapat diketahui bahwa terdapat dua komponen penting dalam kromatografi yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).

            Kromatografi melibatkan pemisahan terhadap campuran berdasarkan perbedaan-perbedaan tertentu yang dimiliki oleh senyawanya. Perbedaan yang dapat dimanfaatkan meliputi kelarutan dalam berbagai pelarut serta sifat polar. Kromatografi biasanya terdiri dari fase diam (fase stasioner) dan fase gerak (fase mobile). Fase gerak membawa komponen suatu campuran melalui fase diam, dan fase diam akan berikatan dengan komponen tersebut dengan afinitas yang berbeda-beda. Jenis kromatografi yang berlainan bergantung pada perbedaan jenis fase, namun semua jenis kromatografi tersebut berdasar pada asas yang sama. (Bresnick, 2004).

            Fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen suatu senyawa analit termasuk asam amino. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) dalam bentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.

            Fase gerak (Mobile phase) merupakan pembawa analit (asam amino), dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa bahan cair dan dapat juga berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah menguap (volatil).

            Jenis kromatografi yang dapat digunakan untuk menganalisi asam amino diantaranya adalah sebagai berikut:

a.       Kromatografi partisi

     Bila suatu zat terlarut didistribusi antara dua pelarut dengan volume sama yang tidak dapat bercampur (immiscible), maka perbandingan konsentrasi zat terlarut di dalam kedua pelarut tersebut dalam keadaan keseimbangan. Perbandingan tersebut disebut koefisien partisi. Asam amino dapat dipisahkan dengan cara partisi dengan menggunakan dua fase terlarut, misalnya pasangan fenol-air atau n-butanol-air. Tiap asam amino mempunyai koefisien partisi tertentu untuk pasangan terlarut tersebut (Wirahadikusumah, 1989).

     Contoh kromatografi partisi adalah kromatografi kolom. Pada kromatografi kolom, kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fase gerak) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa gerak) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fase diam).

     Berdasarkan koefisian partisinya, asam amino yang terdapat dalam campuran bergerak melalui pipa kolom (tabung gela) ke bawah dengan kecepatan yang berbeda-beda. Larutan yang keluar dari bagian bawah pipa kolom disebut eluat. Larutan ini selanjutnya ditampung dalam fraksi-fraksi kecil dengan alat pengumpul fraksi otomatik dan kemudian dianalisa dengan menggunakan periaksi ninhidrin secara kuantitatif (Wirahadikusumah, 1989).

     Reaksi ninhidrin digunakan untuk mendeteksi dan menduga asam amino secara kuantitatif dalam jumlah kecil. Pemanasan dengan ninhidrin berlebih menghasilkan produk berwarna ungu pada semua asam amino yang mempunyai gugus α-amino bebas, sedangkan produk yang dihasilkan oleh protein berwarna kuning, karena pada molekul ini terjadi substitusi gugus α-amino. Pada kondisi yang sesuai intensits warna yang dihasilkan dapat dipergunakan untuk mengukur asam amino secara kolorimetrik. Metode ini amat sensitif bagi pengukuran konsentrasi asam amino (Lehninger, 1982).

     Jumlah asam amino dalam setiap tabung fraksi akan memperlihatkan suatu deret puncak-puncak (peaks) yang masing-masing sesuai dengan jenis asam amino yang terdapat dalam campuran tersebut.

     Penentuan macam asam amino dapat pula dilakukan dengan menghitung harga R_f asam amino yang terdapat pada tabel yang ada (Poedjiadi, 1994).

b.      Kromatografi kertas

     Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis dioleskan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut (fase gerak) yang dapat berupa air, etanol, atau asam asetat.

     Pengguaan kromatografi kertas dalam analisa asam amino dapat memperoleh hasil yang akurat karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi). Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi.

c.       Kromatografi HPLC (High Precision Liquid Chromatography Atau High Performance Liquid Chromatography)

     Prinsip dari kerja HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya, untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan di hitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuntitatif). Alatnya terdiri dari kolom sebagai fase diam dan larutan tertentu sebagai fase geraknya.  Luas puncak kromatografi pada kurva elusi dipengaruhi oleh tiga proses perpindahan massa yaitu difusi Eddy, difusi longitudinal, dan transfer massa tidak seimbang. Sedangakan parameter-parameter yang menentukan berlangsungnya proses-proses tersebut adalah: laju aliran, ukuran partikel, laju difusi, dan ketebalan stasioner.

d.      Kromatografi lapis tipis

     Kromatografi lapis tipis mengggunakan cara tetesan campuran asam amino diibaratkan bergerak melalui suatu lapisan tipis zat penyerap yang didekatkan pada suatu kaca. Pemisahan didasarkan padaperbedaan kecepatan gerakan masing-masing asam amino dalam larutan dapat (buffer) dengan pH tertentu (Wirahadikusumah, 1989).

     Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan olen Egan Stahl dengan menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan lapisan tipis. KLT merupakan kromatografi serapan, tetapi dapat juga merupakan kromatografi partisi karena bahan penyerap telah dilapisi air dari udara. Sebagian besar dasar teori kromatografi kolom juga dapat diterapkan pada KLT. Teknik kromatografi lapis tipis mempunyai kelebihan, yaitu dapat dilakukan proses identifikasi lebih lanjut, dengan mengeruk silika gel (noda larutan contoh), kemudian dilanjutkan dengan identifikasi menggunakan teknik kromatografi kolom.